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   1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用于IgG定量測定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。實驗原理   ①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開,最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化變為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地地放大反應效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。樣本采集   ELISA是蛋白定量的金標準,也是免疫學研究中最常用的實驗方法之一。很多人覺得ELISA很簡單,其實不然。ELISA實驗在操作的過程中還是有很多細節需要大家注意的。所有標本采集過程中,不得使用疊氮鈉做為防腐劑。   細胞培養上清:4000rpm條件下離心20min,去除細胞顆粒和聚合物,上清液保存在- 20℃以下,避免反復凍融。   血漿:肝素,EDTA,或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下,離心20分鐘取上清,血漿保存在-20℃以下,避免反復凍融。   血清:使用不含熱原和內毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,4000rpm條件下離心20min,小心地分離出血清,保存在- 20℃以下,避免反復凍融。血清標本可按常規方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP 為標記的ELISA 測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP,也會產生假陽性反應。一般說來,在3天內測定的血清標本可放置于4℃,標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合,使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需-20℃保存。凍結血清融解后,蛋白質局部濃縮,分布不均,應充分混勻并避免產生氣泡。混濁或有沉淀的血清樣本應先離心或過濾,澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作。標本收集后,不是一次檢測完,請按一次用量分裝凍存,避免反復凍融,使用時在室溫下解凍,確保標本均勻充分解凍。操作步驟   ELISA在操作前試劑和組分都先恢復到室溫,標準品、質控品和樣品,建議做復孔。按前面試劑準備中描述的方法,配制好試劑盒各種組分的工作液。從鋁箔袋中取出所需板條,剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。   設置標準品孔、樣本孔和空白孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,樣本孔加待測樣本50μL,空白孔不加。除空白孔外,標準品孔和樣本孔,加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100μL。用封板膜蓋住反應板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。   溫育好后揭開封板膜,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置20s,甩去洗滌液,吸水紙上拍干。如此重復4次(共洗板5次)。若使用自動洗板機,請按洗板機操作程序進行洗板,添加浸泡20s的程序,可以提高檢測的精度。洗板結束,加底物前,要在干凈不掉屑的紙上,充分拍干反應板。洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應步驟,但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質,以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的,而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA 操作中,洗滌是最主要的關鍵技術,應引起操作者的高度重視,操作者應嚴格按要求洗滌,不得馬虎。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團,也含親水基團,其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合,從而削弱蛋白質與固相載體的結合,并借助于親水基團和水分子的結合作用,使蛋白質回復到水溶液狀態,從而脫離固相載體。   洗板好后將底物A和B按1:1體積充分混合,所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。所有孔加入終止液50μL,在酶標儀上讀取各孔吸光度(OD值)。   檢測完成后,以標準品濃度做為縱坐標,對應的吸光度(OD值)作為橫坐標,利用計算機軟件,采用四參數Logistic曲線擬合(4-pl),創建標準曲線方程,通過樣本的吸光度(OD值),利用方程計算樣品的濃度值。如果樣品被稀釋,通過上述方法測的的濃度值,要乘以稀釋倍數,才是樣品的最終濃度。
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   HBV是引起乙型肝炎(簡稱乙肝)的病原體,屬嗜肝DNA病毒科,該科病毒包含正嗜肝DNA病毒屬和禽嗜肝DNA病毒屬兩個屬,引起人體感染的是正嗜肝DNA病毒屬。HBV感染是全球性的公共衛生問題,隨著基因工程疫苗的生產和投入,乙肝疫苗的普及率逐年上升,感染率呈下降趨勢。(艾恩斯生物現貨供應乙肝病毒系列ELISA試劑盒產品,詳見:http://www.nujoin.tw/web/goods/list/97))   破壞肝臟的乙型肝炎病毒(HBV)每年導致近100萬人死亡。現在,兩項新的遺傳研究表明,至少從人類文明的發源階段開始,這種病原體就已經伴隨在我們左右了。   迄今為止,HBV最古老的證據是在16世紀的意大利木乃伊身上發現的一種菌株。而在其中一項新研究中,由英國劍橋大學遺傳學家Eske Willerslev領導的研究小組,對在遍布整個歐亞大陸的考古遺址中發現的304個個體的完整基因組進行了測序,其中大多數都來自于青銅時代和鐵器時代(大約公元前3500年到公元前500年)。   研究人員很快就在12個個體中發現了HBV的基因特征。其中最古老的樣本——來自一名男性——大約有4500年的歷史,是在德國奧斯特霍芬市的一個古老墳墓中發現的。   隨后,研究小組將這些古老病毒的脫氧核糖核酸(DNA)序列與現代版本的HBV進行了比較,并使用先進的數學建模技術,結合它們在人群中的流行程度,估算了這些變異的產生時間。   數據顯示,這些病毒可能起源于大約公元前13600年至公元前9600年之間。研究人員在5月9日出版的《自然》雜志上報告了這一研究成果。   而另一項由德國耶拿市馬克斯·普朗克學會人類歷史科學研究所遺傳學家Johannes Krause主持的研究,在該國發現的3具骨骼遺骸的牙髓中發現了HBV的痕跡,其年代可以追溯到公元前5000年到公元前3200年。   考慮到這兩項研究的結果,“HBV似乎在過去很常見”,Krause說,他的團隊在上周早些時候發表在bioRxiv預印服務器的一篇論文中報告了這項研究工作。Krause認為,這并不一定是一個驚喜,但它為研究人員未來研究其他古代疾病指明了方向。   有一種流行的假設是,基于黑猩猩和大猩猩的HBV菌株與人類極為相似的事實,這種病毒很可能最早出現于非洲,然后在狩獵或割肉的過程中通過血液與血液的接觸進入人體。從那時開始,隨著人類在距今12萬年到8萬年前進入歐亞大陸,這種病毒可能會擴散到不同的菌株之中。   而Willerslev的研究小組的發現提出了一種有趣的替代可能性,即HBV可能是“最近”才出現在生活在歐亞大陸甚至北美的人類身上,然后在非洲被傳播給人類和非人類靈長類動物,盡管這樣的傳播機制依然是模糊的。   這一時間表與人類文明的開端相吻合,因為人口和貿易路線的擴大將有助于疾病的傳播,并轉化為新的菌株。   然而Krause對這種病毒何時出現的估計結果持懷疑態度。他說,HBV將來自其宿主的遺傳物質重新組合,因此典型的基于基因突變比率的分子年代測定技術并不起作用。   沒有參與這項研究的加拿大漢密爾頓市麥克馬斯特大學進化遺傳學家Hendrik Poinar也認為,鑒于目前的數據,這些限制使得人們很難推測病毒的起源年代。Poinar表示:“在這一點上,關于HBV起源時間的任何說法都是不確定的。”   但是Poinar指出,不管HBV的年齡如何,“這些論文非常漂亮地展示了,你可以在幾千年前的DNA中找到病原體的樣本”。“這種病毒與人類的互動是一種持續了數千年的動態。”
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    艾恩斯生物新品上新:腫瘤標志物類試劑盒    什么是腫瘤標志物?    腫瘤標志物又稱腫瘤標記物,是指特征性存在于惡性腫瘤細胞,或由惡性腫瘤細胞異常產生的物質,或是宿主對腫瘤的刺激反應而產生的物質,并能反映腫瘤發生、發展,監測腫瘤對治療反應的一類物質。腫瘤標志物存在于腫瘤患者的組織、體液和排泄物中,能夠用免疫學、生物學及化學的方法檢測到。  艾恩斯生物最新上新一系列的腫瘤標志物類試劑盒,此類試劑盒應用方法為ELISA,僅供科研使用,不得用于臨床檢驗!  新品列表如下:(點擊產品可查看詳情)癌胚抗原(CEA)定量檢測試劑盒(ELISA)卵巢癌抗原(CA125)定量檢測試劑盒(ELISA)組織多肽抗原(TPA)定量檢測試劑盒(ELISA)鱗狀細胞癌相關抗原(SCC)定量檢測試劑盒(ELISA)乳腺癌標志物-CA153(CA153)定量檢測試劑盒(ELISA)神經元特異性烯醇化酶(NSE)定量檢測試劑盒(ELISA)胃腸癌標志物CA199(CA199)定量檢測試劑盒(ELISA)胰腺癌標志物-CA242(CA242)定量檢測試劑盒(ELISA)P53蛋白(P53)定量檢測試劑盒(ELISA)甲胎蛋白(AFP)定量檢測試劑盒(ELISA)腫瘤標志物(CA724)定量檢測試劑盒(ELISA)細胞角蛋白19(CK19)定量檢測試劑盒(ELISA)細胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)定量檢測試劑盒(ELISA)高爾基體蛋白73(GP73)定量檢測試劑盒(ELISA)內皮細胞特異性分子(Endocan;ESM-1)定量檢測試劑盒(ELISA) 艾恩斯生物作為科研試劑盒生產廠家,所有產品均自主研發生產,進口抗體做原材料,質量保證,操作簡便,數據精準,價格合理,現貨供應,全程技術支持,免費代測,順豐包郵,助力您的科研實驗。 更多新品陸續上新中,歡迎咨詢!!
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